FOXN1和CXCL13在人胸腺组织中的表达及RNAi的初步研究

【摘要】目的：胸腺瘤是最常见的一种前纵隔肿瘤,组织学上类型较多,异质性较强,且各种亚型均可发生侵袭性生长,少数可有远处转移,尽管其病程较长,疗效相对较好,但仍是一种恶性肿瘤。胸腺瘤可伴发多种自身免疫性疾病,如重症肌无力等,除有相应的肌无力的临床表现外,还往往伴有免疫相关因子以及T淋巴细胞亚群的改变,如患者周围血中Th17细胞增多,Treg细胞减少,造成B细胞活性增强而产生过多抗体,诱发自身免疫性疾病的发生,预后差,危害较大。FOXN1和CXCL13是近年发现的两个与胸腺瘤和MG相关的细胞因子。FOXN1主要表达于胸腺上皮细胞,在T细胞的增殖、分化、成熟等方面发挥重要作用,并且在胸腺瘤组织中FOXN1的表达明显增加。但目前FOXN1在胸腺瘤发生中的具体机制尚未明确。CXCL13又称B淋巴细胞趋化因子(BCAl),文献报道CXCL13在多种自身免疫性疾病及肿瘤组织中表达增多,并参与肿瘤细胞的增殖、迁移等过程,但目前尚没有CXCL13关于胸腺瘤发病机制的相关研究。为此,本研究首先从临床角度对不同类型胸腺标本中FOXN1和CXCL13的表达进行检测,并进一步在体外细胞实验中比较上述两种因子在胸腺瘤细胞系和正常胸腺上皮细胞系中的表达差异,利用RNAi;技术探讨FOXN1与CXCL13在胸腺瘤细胞中的上下游支配关系以及两者表达降低对肿瘤细胞增殖的影响。方法与结果：本研究分为2部分。第一部分首先比较不同病理类型胸腺患者免疫学及T细胞亚群的变化,结果显示血清IgG、IgE和C反应蛋白在伴有MG患者中均有异常改变,提示这些均与MG的发生相关,并且胸腺瘤和胸腺增生的MG发病机制有所不同。之后采用HE染色、免疫组织化学以及实时定量PCR等方法分别从蛋白和mRNA水平检测正常胸腺、MG合并增生胸腺、MG合并胸腺瘤组织以及单纯胸腺瘤组织中FOXN1和CXCL13的表达情况,结果显示MG合并胸腺瘤以及单纯胸腺瘤组织中FOXN1、CXCL13表达明显增高,并且两者表达呈现正相关性(MG合并胸腺瘤组织中相关系数r=0.867,单纯胸腺瘤组织中相关系数r=0.834,P<0.05),提示FOXN1、CXCL13可以作为胸腺瘤标志物或参与胸腺瘤的发病,为我们下一步研究两者在胸腺瘤发病中的具体调控关系以及对胸腺瘤细胞增殖的影响提供了依据。第二部分采用WesternBlot以及实时定量PCR等方法分别从蛋白和mRNA水平检测人正常胸腺上皮细胞系CRL-7660和胸腺瘤细胞系Thy0517中的表达差异,结果显示胸腺瘤细胞系中FOXN1、CXCL13表达明显增高,提示Thy0517细胞可以作为下一步RNAi试验的实验细胞。根据基因库中人FOXN1和CXCL13的cDNA序列构建并合成FOXN1-shRNA和CXCL13-shRNA干扰质粒各4条,经测序鉴定构建成功；以脂质体为介导分别将FOXN1-shRNA、CXCL13-shRNA和空质粒psi-H1转染人胸腺瘤细胞系Thy0517,使用RT-PCR方法筛选出能够最大限度下调FOXN1和CXCL13基因表达的干扰质粒HSH020808-1和HSH000672-4。之后利用Westernblot、RT-PCR方法检测分别转染HSH020808-1、HSH000672-4和空质粒psi-H1后,Thy0517细胞中FOXN1和CXCL13的表达,结果显示FOXN1干扰组FOXN1基因和CXCL13基因表达均明显下调,而CXCL13干扰组只有CXCL13基因表达下调,FOXN1作为上游基因调节CXCL13表达。在随后的MTT检测中,FOXN1干扰组和CXCL13干扰组的细胞增殖能力较空质粒组均明显下降,提示FOXN1和CXCL13的高表达具有促进胸腺瘤细胞增殖的作用。结论：胸腺瘤患者血清IgG、IgE和C反应蛋白在MG患者中均有异常改变,,提示这些均与MG的发生相关,并且胸腺瘤和胸腺增生的MG发病机制有所不同。FOXN1和CXCL13在MG合并胸腺瘤和单纯胸腺瘤组织均明显高于正常组织,而FOXN1和CXCL13胸腺瘤细胞系中表达水平明显高于正常胸腺组织,提示FOXN1、CXCL13可能作为MG以及胸腺瘤标志物或参与两者的发生发展；随后的体外RNAi研究表明,下调胸腺瘤细胞系中FOXN1和CXCL13的表达可以明显抑制肿瘤细胞的增殖活性,并且确认上游基因FOXN1对下游基因CXCL13的支配关系,为我们进一步尝试阻断胸腺瘤组织中FOXN1和／或CXCL13的表达来抑制肿瘤生长的治疗方法提供体外实验证据。
【作者】张晖；
【导师】张鹏；
【作者基本信息】天津医科大学，外科学，2013，博士
【关键词】胸腺瘤；重症肌无力；胸腺；FOXN1；CXCL13；RNA干扰；

【参考文献】
[1]金涛.竞技武术套路的艺术特征研究[D].山西师范大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[2]王庆林,付梦印,刘喜梅.模型参考逆方法及其在非线性时变控制系统设计中的应用[J].控制与决策,1999,05:457-459.
[3]王晶,孙宏斌,陈润泽,张扬,吴文传,郭庆来.变电站—调度中心两级分布式网络建模[J].电力系统自动化,2014,09:107-113+151.
[4]张德永.基于RTAI的半物理仿真平台关键技术研究与实现[D].华中科技大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[5]陈晶.从三一集团诉奥巴马案析美国外资并购安全审查制度[D].中国政法大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[6]张雪.现代展示空间设计与研究[D].沈阳理工大学,设计艺术学,2013,硕士.
[7]胡伟.目标管理理论对国税部门绩效评价体系运作的影响研究[D].武汉理工大学,公共管理,2012,硕士.
[8]杨勇.临地空间平台通信信道建模[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2012,硕士.
[9]贾素荣.生态宜居城市建设的研究[D].内蒙古大学,公共管理,2013,硕士.
[10]朱晓坡.多元统计分析的综合评价作用研究[D].贵州民族大学,概率论与数理统计,2013,硕士.
[11]赵虎,尹成,李瑞,徐峰,陈光明,李轩波,傅丽容.基于检波器接收照明能量效率最大化的炮检距设计方法[J].石油地球物理勘探,2011,03:333-338+500+323.
[12]朱建尧.上海市水体沉积物中六溴环十二烷的污染特征、空间分布及季节变化研究[D].上海大学,应用化学,2014,硕士.
[13]王涛.基于ARM的声源定位技术研究[D].沈阳航空航天大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[14]张本禹.商业银行个人住房贷款违约风险影响因素的实证研究[D].山东农业大学,会计（专业学位）,2013,硕士.
[15]李再帏,雷晓燕,高亮.高架轨道交通无砟轨道谱特性分析[J].铁道科学与工程学报,2015,01:40-45.
[16]李西娟.重症监护室患者ICU综合征发生的相关因素分析及护理对策[D].吉林大学,护理学,2014,硕士.
[17]陈士俊.高速公路信息化应用系统平台与数据中心的建设架构[J].交通与计算机,2005,06:39-42.
[18]刘肖.蓝莓抗寒性、需冷量SNP分析与分子辅助育种研究[D].北京林业大学,森林培育,2013,硕士.
[19]李国栋.超声波明渠流量计的研制[D].大连理工大学,机械设计及理论,2004,硕士.
[20]丁柏玲.电子地图中地理对象的智能识别研究[D].大连理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[21]郭芹.张云翠盗窃案研究[D].黑龙江大学,法律,2013,硕士.
[22]邢春杰.柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri）琥珀酸脱氢酶B亚基原核表达及体外与拌种灵药物结合研究[D].南京农业大学,植物病理学,2012,硕士.
[23]梁昊雨.黄姜废渣中木质纤维素的生物降解研究[D].华中科技大学,微生物学,2013,硕士.
[24]孙泽民,王华.铁路通信综合光缆和光电分缆的技术经济分析比较[J].中国铁路.1994(02)
[25]梁筱梅.茂名移动公司市场营销策略研究[D].兰州大学,工商管理,2012,硕士.
[26]唐永发.辽化公司金兴化工厂清洁生产模式研究[D].大连理工大学,工商管理,2003,硕士.
[27]包常喜.面向教育信息化的汉蒙机器翻译的研究[D].内蒙古师范大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[28]李虎.近红外光谱用于原料血浆醇沉过程中IgG含量快速检测研究[D].山东大学,制药工程（专业学位）,2012,硕士.
[29]杨鑫.水和蒸汽的超临界参数计算及超临界锅炉热力计算[D].浙江大学,2013.
[30]王晓春.基于web的教学通用平台的研究与设计[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2011,硕士.
[31]邓星文.先进储能材料产业的专利战略研究[D].湘潭大学,2014.
[32]刘梓林.相切式四圆弧齿轮齿形设计及啮合原理分析[D].宁夏大学,机械工程（专业学位）,2014,硕士.
[33]裘佳寅.靶向HIV-1 gp41的病毒进入抑制剂的筛选及gp41 Loop疏水中心的功能研究[D].南方医科大学,药理学,2014,博士.
[34]吕柏权,李天铎,吕崇德,刘兆辉.一种用于函数学习的小波神经网络[J].自动化学报,1998,04:118-121.
[35]宋建伟.CF/有机硅树脂中温固化复合材料制备及性能研究[D].哈尔滨工业大学,化学工程,2014,硕士.
[36]闫刚.具有操作监控的加密移动存储设备软件设计与实现[D].南京理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[37]史文文.中国当代油画创作中色彩平面化的运用[D].山东大学,美术（专业学位）,2013,硕士.
[38]肖媛妩.中国普通高等学校艺术教育初探[D].中国艺术研究院,音乐学,2004,硕士.
[39]王海婧.水闸安全鉴定技术研究与实践[D].山东大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[40]周剑峰,杨兆升.GIS在城市交通共用信息平台中的应用[J].吉林大学学报(工学版),2005,02:183-186.
[41]王辰.不同非稳条件下正弓箭步动作主要工作肌群用力特征的对比个例[D].北京体育大学,康复医学与理疗学,2013,硕士.
[42]张文艺.工作流程管理系统的访问控制研究与实现[D].南京航空航天大学,机械电子工程,2004,硕士.
[43]张会.基于视觉显著性的目标识别[D].杭州电子科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[44]李今民,薛兴昌.提高工业控制微型机系统可靠性的措施[J].冶金自动化,1984,06:39-42.
[45]聂永红.判定树归纳分类法在毕业生就业预测中的应用[J].广西科学院学报,2003,02:72-76.
[46]李书涛.城市轨道交通与常规公交换乘能力可靠性分析[D].北京交通大学,2008.
[47]关雅倩.改良QuEChERS方法联合LC-MS/MS技术在茶叶中农药残留分析检测的应用研究[D].北京化工大学,化学,2013,硕士.
[48]赵欢欢.建筑施工企业核心人才流失隐性成本显性化研究[D].西安建筑科技大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[49]穆成坡,黄厚宽,田盛丰.入侵检测系统报警信息聚合与关联技术研究综述[J].计算机研究与发展,2006,01:1-8.
[50]马章.高原铁路车站信号电源组成方案[J].铁道通信信号.2002(04)